实验进展书面报告
一．实验目标
1.帮助师兄纯蛋白并进一步熟练纯蛋白的实验操作技能。
2.手提质粒，测质粒浓度
3.学习测p450酶蛋白的浓度
4.掌握基因定点突变的原理和基因定点突变完整的实验操作流程。
二．实验进展
1.纯蛋白的实验操作过程：
（1）4度，4000-8000rpm,15-30分钟，收集菌体，沉淀可冻于-80度保存。
（2）配制lys buffer,wash buffer,desalting buffer,最后配制elution buffer 溶液，调节PH时要精确。
（3）加入适当的lys buffer,1000毫升菌液收集的菌体，加入30毫升即可，太少超声时容易起泡。
（4）混合震荡，没有块状，成为均匀的溶液。（菌体要放在冰上）
（5）往冰桶里面加冰，超声细胞破碎仪进行破碎菌体，开2.0秒。关4.0秒。超声破碎时间30分钟。（在进行超声细胞破碎时，一定要把小烧杯边缘卡在线圈的地方）
（6）用离心机离心掉菌体（离心1小时，10000rpm）.去除菌体碎片，取上清备用，(一定不要菌体碎片，上清液包括蛋白质，细胞内容物，lysbuffer缓冲液)
(7)洗 Ni 柱，假设有乙醇，用清水进行洗第一遍，再用lys buffer 洗一遍，留点 lys buffer 液体，lys buffer 液体与蓝色体积1:1比例，使Ni 柱重悬起来，加Ni柱，（500毫升培养基加2毫升Ni柱，1升的培养基加3-4，5毫升NI柱。500毫升培养基加3毫升Ni柱。）
（8）将加过Ni 柱的上清液放在4度，使其充分动态混合，转速不可太快，保护Ni 柱，使Ni柱和上清液充分融合，进行孵育。
（9）将lysbuffer 加入柱子中，（选择用10毫升的枪加入试剂），流完之后，将上一步的液体加入小的柱子中。
（10）上一步液体过滤完之后，加入wash buffer 洗两遍，（目的是将杂蛋白洗下来）
（11）在普通过滤管下面接试管，往普通过滤管中加入4毫升的elution buffer ,将目的蛋白洗脱下来。
(12)提前预约离心机，超滤管中要有乙醇的味道，先用纯水洗掉乙醇味，并在超滤管中加入desalting buffer溶液，将desalting buffer 溶液离心下来，5000-5500rpm,60分钟，4度。
（13）将洗脱下来的蛋白装入超滤管中，用离心机进行浓缩，5500rpm,60分钟，4度。离心之后将超滤管中外管的液体扔掉，（14）将浓缩以后的蛋白中加入4毫升的desalting buffer,离心浓缩5500rpm ,1小时，目的是去除目的蛋白中的咪唑。（要轻轻的进行，同时速度要快，保证温度）要是使用脱盐柱，首先对脱盐柱进行清洗，一次加5毫升desalting buffer,每管加25毫升，将浓缩好的蛋白加入到脱盐柱中，一次加2.5毫升蛋白溶液。
（15）纯到的蛋白分装到EP 管中，在分装之前一定要将酶混匀，以免影响酶浓度的测量，用液氮快速冷冻，-80度保存。（1.5ml的ep管当中加入300UL的酶，PCR管中加入100ul 的酶。）
清洗：柱子用elution buffer,洗两遍，用二级水洗一遍，留点二级水重悬起来加到Ni柱里面。脱盐柱的清洗，每次加5毫升的desalting buffer,一共加够25毫升。最后的5毫升留着保持脱盐柱里面的填料湿润）。
2.大肠杆菌中质粒的提取制备和DNA浓度的测定
（1）接菌:在超净台操作，接1.8毫升菌液到2毫升的EP管中。
（2）将过夜培养的菌液14000rpm,离心2min,收集菌体，弃掉上清。
（3）加入200ul buffer p1溶液，置于振荡器上1300rpm,震荡10min.（4）加入200ul buffer p2溶液，震荡3次，每次3秒。
（5）加入200ul buffer p3溶液，震荡3次，每次3秒。
（6）上下颠倒3次，14000rpm,离心20min.（7）在新的无菌1.5ml EP管中加入500ul 异丙醇。
（8）将步骤 6 中所得到的上清液转移到异丙醇的1.5ml EP管中。
（9）剧烈震荡，14000rpm,离心20min.(10)弃掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上。
（11）将EP 管放置于双面板上，加入1毫升75%乙醇，倒掉乙醇，用吸水纸吸干EP管壁上残留的乙醇。
（12）将干燥的质粒溶解于适量的双蒸水中，并测双链DNA的浓度。
3.学习测P450酶蛋白浓度
(1)用15毫升离心管先稀释蛋白，例如960ul desalting buffer +40ul p450酶 放在15ml 离心管中，稀释之后的颜色为淡黄色。
(2)准备物品（比色皿，保险粉，勺子，封比色皿的封口膜，1毫升的枪和枪头，比色皿最小1毫升，）
(3)吹co,测量的是活性蛋白的浓度，蛋白与co 结合才会有活性。（用15毫升离心管防止蛋白溶液被吹出来）
(4)先测不加保险粉的P450,再测加入 保险粉之后的P450,操作要迅速，因为保险粉和溶液反应速度很快。
(5)作图,看图可以看在420nm处是否还有峰
(6)计算；p450酶蛋白的浓度等于（两次测量差值450nm处的OD-两次测量差值490nm处的OD）*91000*1000*1000*稀释倍数。
4.基因的定点突变
（一）定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另一个碱基。
（二）定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，得到PCR产物，将产物进行转化，再筛选阳性克隆，最后测序验证。
（三）引物设计原则
（1）通常引物长度为25-45bp,我们建议引物长度为30-35bp.一般是要以突变的碱基为中心，加上两边的一段序列。两边长度至少为11-12bp.若两边引物太短，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设12个bp,并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30bp,接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78度，（GC含量应大于40%）.(3)如果Tm值低于78度，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78度。（GC含量大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41*(%of GC)-675/L+81.5.注：L:引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
（四）定点突变操作步骤
用待突变的质粒为模板，用设计的引物及高保真酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。
1）设计点突变引物。
2）准备模板质粒DNA.3）反应体系(50ul 反应体系)
PCR反应体系与反应条件
成分
用量
PrimerSTAR Max
25 µL
Template DNA
1µL
Primers(10 µM)
2 µL each
ddH2O
22µL
Stage 1: 98℃, 3 min(预变性)
Stage 2: 98℃, 15 s(变性);
Tm 63℃,10 s(退火);72℃, 2kb/min(延伸);35个循环
Stage 3: 72℃,10min
Stage 4: 4℃,
4)酶切
一般来说50ul PCR 产物加1ul酶（Fast Digest Dpn1）,10x Fast Digest Dpn1 buffer 稀释成 1x Fast Digest Dpn1 buffer.37度下反应3小时。
5)胶回收
a)加1xTAE 30ml(小胶 30毫升，中胶 50毫升，大胶100毫升)
b)加 1%琼脂糖 0.3g
c)加热 2分钟，沸腾。
d)加入核酸染料 30ml中一般加入3ul.e)倒胶（胶的形成一般是20-30min）
f)将loading buffer 和酶切产物融合，进行跑胶，loading buffer加一滴，酶切产物全部加入.g)进行跑胶，30分钟。
h)切完胶之后，称量胶的净重，（注意胶不要切的太厚，切下目的基因片段即可），1;1加入 bling buffer,1g加入1毫升，0.5g加入0.5毫升。做胶回收所用的试剂在（Gel Extraction Kit）的盒子里。
i）在55度的金属水浴锅中加热，让里面的胶溶解，时常拿出来看一看，晃一晃，让里面的胶溶解的快一些。
j）准备好套管，将溶解好的DNA加到套管里面（一次加入750ul）,一定要注意换枪头。先让DNA液体过滤一遍，往套管中加完DNA液体之后，11000rpm,30s(1min).k）使用SPW wash buffer 洗两遍，先看SPW wash buffer 上面画对勾没，画对勾的话说明加了乙醇，加入750ulspw wash buffer,(套管当中一次最多加入750ul 的液体)，加完spw wash buffer 液体之后进行离心，第一次离心11000rpm,30s;第二次加750 ul spw wash buffer 之后离心11000rpm,1分钟。
l）之后11000rpm,2min 空离，（实际上离心的是wash buffer 里面的乙醇）把套管里面小管外壁的乙醇离心下来，（切不可忘记）
m）把套管外的大管扔掉，此时加上一个2ml 的EP管，在外面开口晾晒3min ，n）加买来的elution buffer,每个小管加入30 ul Elution buffer,在加elution buffer 之前要将elution buffer 加热一下，将elution buffer 加到套管里面小管的正中心，要轻轻的进行，不可以把小套管里面的膜弄坏，加完elution buffer 之后，让他们融合2 Min，开始离心11000rpm,2min ,在套管外面离心下来的是DNA.6)体外重组
7）转化
（a）等质粒和感受态细胞(BL21感受态细胞)在冰上融化后再使用。质粒与感受态混匀，在冰上放置30Min，（1.5mlEP管）.感受态和质粒混匀一定要轻轻的，不能用枪吹打混匀，用手轻轻的拨动，做完马上要插在冰上，可以把冰盒放在超净台里面。
（b）热激 42度水浴90 秒，在冰上放置2分钟,降温。
（c）加入1ml 的LB 培养基，提供营养。
（d）37 度摇床1 小时，（e）离心浓缩，去除部分上清液后与沉淀混合均匀后涂布，具体操作（剩余50-100 ul，然后吸取一半的菌液进行涂布平板）100毫升LB培养基倒四个板子，吹板子吹十分钟。
（f）37度培养后根据菌落进行筛选（卡纳抗性）
（g）在2ml 的EP管中加入1.8ml的LB 培养基和相应的抗生素之后，挑取单克隆菌落，进行摇菌培养。
（h）提取质粒DNA.8）测序
验证目的基因的碱基顺序
9）保菌和划板
10)挑取单克隆摇菌培养作为种子液，11）发酵
12）纯蛋白
13)酶反应
14）液相检测
三．实验总结
1．进一步熟练实验室中的基本实验操作技能，在做转化操作时要保证严格的无菌操作！做实验过程中要认真。
2.基因的定点突变做到纯蛋白这一步骤，后续的酶反应和液相检测及产物的分析，是潘师兄做的，我跟着进一步学习，基因的定点突变做了三个包括（Pikc-E48Y；Pikc-N392Y；Pikc-U242Y）；三种基因的定点突变，均纯到蛋白。
四．未来计划
1.继续学习实验操作技能，重点在HPLC的独立使用，和引物的设计。
2.帮助师兄发酵和纯蛋白。
3．熟练掌握更多的定点突变，并进行深入的思考和总结。
4.学习理论知识，细读文献。
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